怎樣避免處理PCR實(shí)驗(yàn)室污染
PCR檢測(cè)因其高靈敏度、快速、操作方便等優(yōu)勢(shì)已經(jīng)被廣泛應(yīng)用,不過正是由于它靈敏度極高,極微量的污染源都有可能導(dǎo)致檢測(cè)結(jié)果的假陽(yáng)性,因此,如何避免以及處理實(shí)驗(yàn)室污染,對(duì)PCR人來說是一門必修課。
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實(shí)驗(yàn)室污染分類
樣本間交叉污染
主要是在采(取)樣的過程中,由于取樣工具之間的交叉造成污染;或者在核酸提取的過程中,由于移液器、離心管等使用不當(dāng)導(dǎo)致的污染。?
PCR試劑的污染
主要是在PCR試劑配制過程中,由于移液器、容器、陰性對(duì)照及其它試劑被核酸模板或陽(yáng)性對(duì)照污染。
克隆質(zhì)粒的污染
在實(shí)驗(yàn)室操作中經(jīng)常會(huì)用到陽(yáng)性參考品,這些陽(yáng)性參考品大多數(shù)是由某些克隆質(zhì)粒制作而成,克隆質(zhì)粒在單位容積內(nèi)濃度高,不小心使用極易造成污染。
PCR擴(kuò)增產(chǎn)物污染
這是PCR反應(yīng)中最主要最常見的污染問題。因?yàn)镻CR產(chǎn)物拷貝量大,遠(yuǎn)遠(yuǎn)高于PCR檢測(cè)數(shù)個(gè)拷貝的極限,所以極微量的PCR產(chǎn)物污染,就可造成假陽(yáng)性結(jié)果。還有一種容易忽視,最可能造成PCR產(chǎn)物污染的形式是氣溶膠污染,在空氣與液體面摩擦?xí)r就可形成氣溶膠,據(jù)計(jì)算一個(gè)氣溶膠顆??珊?.8萬(wàn)拷貝,因而由其造成的污染是一個(gè)值得特別重視的問題。
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消除污染的操作步驟
1.物料準(zhǔn)備
(1)購(gòu)買噴壺(能夠噴出霧狀水汽的即可);
(2)購(gòu)買市面上有效氯消毒片,根據(jù)要求配制不同濃度的消毒液,或者購(gòu)買成品次氯酸鈉消毒液配制合適濃度消毒水;
(3)購(gòu)買核酸氣溶膠污染清除劑(DNA AWAY?原液/MediClean?稀釋100倍);
(4)無(wú)紡布/無(wú)塵紙等。
2.處理方法
(1)清理廢液缸并且對(duì)廢液缸用有效氯含量為2000mg/L消毒水浸泡消除核酸污染;
(2)用有效氯含量為2000mg/L消毒水對(duì)移液槍進(jìn)行擦洗,關(guān)鍵部位為移液槍前端易污染部位,清潔干凈后用潔凈水再擦拭一遍;
(3)將離心管架、擴(kuò)增管架、擴(kuò)增管架底板、吸嘴盒及其他相關(guān)物品用有效氯含量為500mg/L的消毒水浸泡2小時(shí)后,用清水沖洗干凈晾干后使用;
(4)對(duì)污染區(qū)域內(nèi)的設(shè)備如擴(kuò)增儀、全自動(dòng)提取儀等,使用核酸氣溶膠污染清除劑進(jìn)行反復(fù)處理;對(duì)生物安全柜等含有空氣過濾系統(tǒng)的設(shè)備,需更換過濾網(wǎng);
(5)用有效氯含量為500mg/L的消毒液對(duì)整個(gè)實(shí)驗(yàn)室(地板、墻面、天花板、門、窗戶等地方)進(jìn)行清潔,并且用用有效氯含量為1000mg/L的消毒水對(duì)實(shí)驗(yàn)室進(jìn)行噴霧消毒(重點(diǎn)部位為操作區(qū)),有效降解空氣中的氣溶膠與附著在實(shí)驗(yàn)臺(tái)表面的核酸污染;同時(shí)加大通風(fēng)量(內(nèi)循環(huán)無(wú)用,盡可能外循環(huán));
(6)待污染區(qū)域及設(shè)備器件清理完成后,常用設(shè)備和操作臺(tái)面使用移動(dòng)紫外消毒車近距離輻照1小時(shí);實(shí)驗(yàn)室內(nèi)則使用室內(nèi)紫外燈整晚輻照。
步驟(1)-(6)必須堅(jiān)持每天進(jìn)行,確保消除實(shí)驗(yàn)室污染;
3.污染消除判斷標(biāo)準(zhǔn)
設(shè)計(jì)陰性對(duì)照組,根據(jù)陰性對(duì)照確認(rèn)污染情況??墒褂贸ㄩ_后隔夜放置操作區(qū)的陰性對(duì)照進(jìn)行實(shí)驗(yàn)(在單獨(dú)的實(shí)驗(yàn)室驗(yàn)證),若連續(xù)三天陰性對(duì)照沒有起跳,則說明污染得到控制,可恢復(fù)正常實(shí)驗(yàn)。
當(dāng)然,為最大程度的降低可能出現(xiàn)的PCR污染或杜絕污染的出現(xiàn),在實(shí)驗(yàn)室前期設(shè)計(jì)及日常實(shí)驗(yàn)室管理和操作中,就需要進(jìn)行合理的規(guī)劃以及嚴(yán)格執(zhí)行實(shí)驗(yàn)室SOP,把污染的可能性扼殺在搖籃中。