一、 PCR實驗室規(guī)劃設(shè)計
如何建一個標準的PCR 實驗室？PCR實驗室如何設(shè)計規(guī)劃才堪稱專業(yè)？PCR實驗室管理又有哪些注意要點？
標準的PCR 實驗室分為四個區(qū)域，分別為：
n1.試劑配制區(qū)；
n2.樣品處理區(qū)；
n3.核酸擴增區(qū)；
n4.產(chǎn)物分析區(qū)；
如使用全自動分析儀，區(qū)域可適當(dāng)合并。（進入各工作區(qū)域必須嚴格按照單一方向進行，不同的工作區(qū)域使用不同的工作服，例如不同的顏色。工作人員離開各工作區(qū)域時，不得將工作服帶出）
PCR實驗室平面布局
【各區(qū)的功能分別為】
試劑準備區(qū)：擴增試劑的配制、分裝和保存。
樣品處理區(qū)：樣品登記、分裝；核酸提取、保存和加樣。
擴增產(chǎn)物分析區(qū)：擴增產(chǎn)物的測定、結(jié)果分析、登記及報告。
擴增前區(qū)與擴增后區(qū)應(yīng)嚴格分開，須使用不同的房間，兩區(qū)之間最好有一定的間隔。
使用商品化試劑盒可在樣品處理區(qū)進行少量試劑配制。
在滿足下列操作和清潔處理要求的前提下樣品處理區(qū)和試劑準備區(qū)可設(shè)在同一房間內(nèi)：
在生物安全柜內(nèi)操作；
每個實驗人員、實驗組分別使用各自的試劑及耗材；
盛放污染材料的器皿密封并一次性使用；
用有效的方法對操作區(qū)域和共享器具在實驗前后進行清潔及消毒。
PCR實驗室建設(shè)規(guī)劃要點
1、主體結(jié)構(gòu)：
主體為彩鋼板、鋁合金型材。室內(nèi)所有陰角、陽角均采用鋁合金50內(nèi)圓角鋁，從而解決容易污染、積塵、不易清掃等問題。結(jié)構(gòu)牢固，線條簡明，美觀大方，密封性好。
2、標準的三區(qū)分隔和氣壓調(diào)節(jié)：
將PCR過程分成試劑準備、標本制備和PCR擴增檢測三個獨立的實驗區(qū)。整個區(qū)域有一個整體緩沖走廊。每個獨立實驗區(qū)設(shè)置有緩沖區(qū)， 同時各區(qū)通過氣壓調(diào)節(jié)，使整個PCR實驗過程中試劑和標本免受氣溶膠的污染并降低擴增產(chǎn)物對人員和環(huán)境的污染。
可打開緩沖區(qū)Ⅰ，緩沖區(qū)Ⅱ和 PCR 擴增區(qū)的排風(fēng)扇往外排氣，在實驗區(qū)的外墻上和各扇門上都安裝有風(fēng)量可調(diào)的回風(fēng)口，空氣通過回風(fēng)口向室內(nèi)換氣。
3、 消毒：
在三個實驗區(qū)和三個緩沖區(qū)頂部以及傳送窗內(nèi)部安裝有紫外燈，供消毒用。
在試劑準備區(qū)和標本制備區(qū) 還設(shè)置移動紫外線燈，對實驗桌進行局部消毒。
4、機械連鎖不銹鋼傳遞窗：
試劑和標本通過機械連鎖不銹鋼（不建議使用電子連鎖方式）傳遞窗傳遞，保證試劑和標本在傳遞過程中不受污染（人物分流）
5、 地面
地面建議使用PVC卷材地面或自流坪地面，整體性好。便于進行清掃，耐腐蝕。沒有條件的也可采用水磨石地面，或大塊的瓷磚（至少800mm×800mm）接縫需要小于2mm。
6、照明
燈具要選用凈化燈具，能達到便于清洗、不積塵的特點。
在建設(shè)的過程中應(yīng)注意
●規(guī)范的安裝流程和全面的服務(wù)流程。
●嚴格按照規(guī)范科學(xué)設(shè)計的安裝流程。
●安裝前需要確定以下安裝條件，如：電源電壓，電源進線位置，電話網(wǎng)絡(luò)線進線位置，進水水壓，最小安裝空間，地面平整度，通風(fēng)孔、進水管和下水管的位置等，理想狀態(tài)的空間尺寸和通風(fēng)口尺寸。
設(shè)計要點
PCR實驗室可以是分散形式，也可以是組合形式。完成一組PCR實驗，通常應(yīng)經(jīng)過試劑配制、樣品處理、核酸擴增及產(chǎn)物分析四個實驗過程，若實驗工藝需要，還應(yīng)增加樣品粉碎過程。
一、分散形式PCR實驗室
所謂分散形式PCR實驗室，是指完成上述實驗過程的實驗用房彼此相距較遠，呈分散布置形式。對于這種布置形式的PCR實驗室，由于各個實驗之間不易相互干擾，因此無需特殊條件要求。
二、組合形式PCR實驗室
所謂組合形式PCR實驗室, 是指完成PCR四個實驗過程的實驗用房相鄰布置，組成獨立實驗區(qū)域的形式。對于組合形式PCR實驗室，由于各個實驗間集中布置，容易造成相互干擾，因此，對總體布局以及屏障系統(tǒng)具有一定的要求。各室在入口處設(shè)緩沖間，以減少室內(nèi)外空氣交換。
一些經(jīng)驗：
試劑配制室及樣品處理室宜呈微正壓，以防外界含核酸氣溶膠的空氣進入，造成污染；
可以通過控制進風(fēng)風(fēng)量大于排風(fēng)風(fēng)量達到正壓效果。
核酸擴增室及產(chǎn)物分析室應(yīng)呈微負壓，以防含核酸的氣溶膠擴散出去污染試劑與樣品，可以通過控制排風(fēng)風(fēng)量大于進風(fēng)風(fēng)量達到負壓效果。
在理想情況下，PCR實驗室緩沖間內(nèi)，可設(shè)置正壓，使室內(nèi)空氣不流向室外，室外空氣不流向室內(nèi)。PCR實驗室進風(fēng)由原有中央空調(diào)控制，要求將中央空調(diào)風(fēng)口安裝到指定定點，且高度為地面鋪裝好后2600mm處。
如果使用熒光PCR儀，擴增室和產(chǎn)物分析室可以合并。
若房間進深允許，可設(shè)PCR內(nèi)部專用走廊。需要指出的是在減少室內(nèi)外空氣交換方面，緩沖間比專用走廊更有意義。
各個區(qū)域之間應(yīng)具備單向的實驗工藝流、物流、人流與氣流，形成單向流程的保護屏障，避免實驗之間的相互干擾，防止核酸氣溶膠對實驗過程造成污染產(chǎn)生假性結(jié)果。
實驗室的墻體，包括頂棚，應(yīng)結(jié)構(gòu)牢固、氣密性好；所有陰角宜采用圓弧形線條過渡；墻體內(nèi)壁光潔、不吸附、耐腐蝕、易清洗消毒；地面材料應(yīng)滿足無縫隙、無滲漏、光潔、耐腐蝕的要求。
PCR實驗室主要設(shè)備
試劑準備區(qū)
儀器設(shè)備主要有冰箱、超凈臺、加樣器、混勻器、天平和離心機等，加樣器、天平除了要專用外，還應(yīng)有定期校準。試劑分裝應(yīng)在超凈臺中進行 擴增反應(yīng)混合液應(yīng)使用分子生物學(xué)級的，試劑制備好后應(yīng)有質(zhì)檢：一是否有污染、二是檢測試劑的擴增效果。
標本制備區(qū)
儀器設(shè)備主要有生物安全柜、加樣器、離心機、溫育儀、混勻器等
擴增區(qū)
擴增區(qū)的主要儀器是核酸擴增儀、超凈臺、微量加樣器、離心機、可移動紫外燈。擴增儀需進行校準。并配備UPS電源，以防止由于電壓的波動，停電對擴增效果的影響。
分析區(qū)
本區(qū)所使用的儀器設(shè)備有酶標儀、洗板機、加樣器和水浴箱等 潔凈實驗區(qū)的緩沖間部分面積不能超過主實驗室的八分之一,這是有規(guī)定的。
一些瑣碎的、不可忽略的設(shè)計
1.實驗室空調(diào)通風(fēng)系統(tǒng)設(shè)計及壓力控制
PCR實驗室并沒有嚴格的凈化要求，但是為避免各個實驗區(qū)域間交叉污染的可能性，宜采用全送全排的氣流組織形式。同時，要嚴格控制送、排風(fēng)的比例以保證各實驗區(qū)的壓力要求。
2.污染的預(yù)防與控制
PCR實驗室設(shè)計的核心問題是如何避免污染。在實際工作中，常見的有以下幾種污染類型：擴增產(chǎn)物的污染；天然基因組DNA的污染；試劑的污染以及標本間的污染。由于一旦發(fā)生污染，實驗就必須停止，直到找到污染源為止，而且實驗結(jié)果必須作廢，需重新進行實驗。所以發(fā)生污染后再圍繞實驗室來尋找污染源不但耗時而且繁瑣，浪費人力物力。因此要避免污染，首先應(yīng)是預(yù)防，而不是排除。
PCR實驗室不可缺少的嚴格管理
（1）嚴格控制進出實驗室的人員。與實驗無關(guān)的人員不得隨意進出實驗室，有條件的情況下要設(shè)置獨立的通道和進出整個實驗區(qū)的門；
（2）盡量減少在實驗區(qū)內(nèi)不必要的走動以減少交叉污染的可能性。
（3）擴增產(chǎn)物分析區(qū)是最主要的擴增產(chǎn)物污染來源，廢液不能在實驗室中傾倒，必須經(jīng)消毒液浸泡消毒后在遠離實驗室的地方棄掉，用過的吸頭等一次性材料也應(yīng)經(jīng)消毒液浸泡消毒后統(tǒng)一處理，如焚燒等；
（4）擴增產(chǎn)物分析區(qū)可能會用到某些可致基因突變和有毒物質(zhì)，應(yīng)特別注意實驗人員的安全防護。3.5完備的實驗室配套設(shè)施 完備的實驗室配套設(shè)施是保證實驗工作的必要條件，應(yīng)根據(jù)各個實驗室實驗內(nèi)容的不同配備相應(yīng)的設(shè)備和儀器，如超凈工作臺、離心機、加樣器等。
二、 PCR實驗室防污染措施及應(yīng)急處理方法
污染，是PCR實驗室出現(xiàn)實驗假陽性、結(jié)果不可信、研發(fā)不可靠的重要推手，PCR實驗室應(yīng)當(dāng)將防污染作為日常管理、實驗安排、清潔消毒、實驗習(xí)慣的核心。PCR 實驗污染和細胞污染是有差別的，PCR 實驗污染主要是核酸而不是細菌和其他入侵者。因此所有的預(yù)防措施都會稍稍有所不同。“易查不易察”，污染來的悄無聲息，我們該如何應(yīng)對。今天給大家簡單介紹一下PCR實驗室的主要污染來源、實驗中如何避免和減少污染的可能性及實驗發(fā)生污染的應(yīng)急處理方案。
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PCR實驗室的污染來源
1、樣本間交叉污染：
收集樣本的容器被污染或樣本密封不嚴外溢；不同樣本移液時忘記更換槍尖或未使用帶濾芯槍尖；移液器等實驗器具及耗材未及時消毒滅菌；不同樣本同時開蓋或樣本劇烈震蕩、反復(fù)吹吸導(dǎo)致氣溶膠形成擴散，相互交叉污染。
2、實驗試劑污染：
主要是在 PCR 組分試劑加樣過程中，由于移液器、容器、陰性對照及其它試劑被核酸模板或陽性對照污染。 加樣過程中，因為 PCR 試劑對溫度十分敏感，需要通過冰浴使得 PCR 試劑和 PCR 板/管處于 0℃，但這個過程也是充滿了污染的風(fēng)險的。
3、擴增產(chǎn)物污染：
大量拷貝的產(chǎn)物泄漏或擴增后的PCR反應(yīng)管意外開蓋，這是 PCR 反應(yīng)中最主要最常見的污染問題。因為 PCR 產(chǎn)物拷貝量大，遠遠高于 PCR 檢測數(shù)個拷貝的極限，所以極微量的 PCR 產(chǎn)物污染，就可形成假陽性。
4、克隆質(zhì)粒污染：
作為陽性質(zhì)控品的克隆質(zhì)粒外溢。
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PCR實驗室的防污染方法
按照實驗室的安全工作制度或安全標準操作程序，所有操作符合《實驗室生物安全通用要求》（GB19489-2008）。
1、嚴格執(zhí)行各區(qū)功能劃分：
試劑儲存和準備區(qū)：貯存試劑的制備、試劑的分裝和擴增反應(yīng)混合液的準備，以及離心管、吸頭等消耗品的貯存和準備。
標本制備區(qū)：核酸（RNA、DNA）提取、貯存及其加入至擴增反應(yīng)管。對于涉及臨床樣本的操作，應(yīng)符合生物安全二級實驗室防護設(shè)備、個人防護和操作規(guī)范的要求。
擴增區(qū)：cDNA合成、DNA擴增及檢測。
擴增產(chǎn)物分析區(qū)：擴增片段的進一步分析測定，如雜交、酶切電泳、變性高效液相分析、測序等。
試劑準備區(qū)、樣本制備區(qū)和擴增區(qū)內(nèi)的實驗用品，包括移液器等器具應(yīng)專用，空氣、物品流向依次為：試劑準備區(qū)、樣本制備區(qū)、擴增區(qū)、產(chǎn)物分析區(qū)，不可逆行。
2、清潔的實驗用品：
實驗室自配試劑（去離子水、緩沖液等）和所有使用器具在使用之前均應(yīng)高壓滅菌或紫外殺菌。槍尖、反應(yīng)管等實驗耗材應(yīng)一次性使用。
3、正確的實驗操作：
實驗應(yīng)在超凈工作臺內(nèi)進行，工作臺內(nèi)應(yīng)放置PCR專用的微量離心機、各量程的移液器和其他必須物品。
實驗的過程中選擇最合適尺寸的手套并能及時更換，在進出不同實驗區(qū)域或進行模板操作后都應(yīng)更換實驗服、口罩、帽子及手套，以避免不同實驗區(qū)交叉污染。
裝有PCR試劑的反應(yīng)管在打開之前應(yīng)先瞬時離心，將管壁及管蓋上的液體離至管底，降低污染手套或加樣器的風(fēng)險；謹慎開啟反應(yīng)管，防止管內(nèi)液體濺出或形成氣溶膠導(dǎo)致污染。
吸加試劑和模板的操作應(yīng)嚴格按照規(guī)范要求進行，遵守“慢吸快打”原則，盡量一次性完成，忌多次抽吸，以避免氣溶膠產(chǎn)生的交叉污染。
PCR試劑建議小量分裝，以減少反復(fù)凍融、重復(fù)取樣次數(shù)；多樣本PCR反應(yīng)時，先配制反應(yīng)混合液分裝至反應(yīng)管中，最后加入樣本核酸，請勿同時開蓋，盡量保證單人單管，實現(xiàn)完全閉管操作。
實驗試劑應(yīng)與樣品和PCR產(chǎn)物分開保存，不應(yīng)放于同處。
PCR擴增實驗完成后及時將反應(yīng)管取出，用一次性手套將產(chǎn)物反應(yīng)管包裹丟棄，保證管蓋緊閉。
4、規(guī)范的實驗設(shè)計：
應(yīng)遵循實驗室內(nèi)部質(zhì)量控制的相關(guān)規(guī)定，實驗中設(shè)立陽性對照、陰性對照和空白對照，全程質(zhì)控實驗過程，驗證PCR反應(yīng)的可靠性，并協(xié)助判斷擴增系統(tǒng)的可信性。
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PCR實驗室的污染應(yīng)急處理方法
1、若核酸樣本溢出：
立即用布或紙巾覆蓋，由外圍向中心傾倒10%的次氯酸消毒劑，約30分鐘后，清除污染物品，再用次氯酸消毒劑擦拭，并用75%酒精噴灑，移動紫外車定點照射1小時。
2、其他不明情況污染：
1、暫停所有實驗操作；
2、清理實驗室內(nèi)所有物品，尋找污染來源；
3、加大實驗室的通風(fēng)；
4、對實驗室內(nèi)所有表面（臺面、地面及墻面） 進行消毒；
5、75%酒精空中噴霧；
6、開啟紫外消毒裝置，延長紫外照射時間（4小時以上）；
7、以上措施每日進行，直至污染消除；用新試劑及確認無污染的器材進行原污染項目的試劑空白檢測，連續(xù)3次均陰性后方可進行常規(guī)檢測。
PCR污染的范圍很廣，不同樓層也會產(chǎn)生影響，甚至?xí)绊懴噜徑ㄖ?；PCR污染的時間很長，幾個月甚至半年；PCR污染的影響很深，影響我們的生產(chǎn)計劃，阻礙我們的研發(fā)進度，直接造成公司人力、財力的損失。但隨著新技術(shù)和一些問題的明晰，無污染PCR檢測的那一天離我們會越來越近！
