一、 PCR實(shí)驗(yàn)室規(guī)劃設(shè)計
如何建一個標(biāo)準(zhǔn)的PCR 實(shí)驗(yàn)室？PCR實(shí)驗(yàn)室如何設(shè)計規(guī)劃才堪稱專業(yè)？PCR實(shí)驗(yàn)室管理又有哪些注意要點(diǎn)？
標(biāo)準(zhǔn)的PCR 實(shí)驗(yàn)室分為四個區(qū)域，分別為：
n1.試劑配制區(qū)；
n2.樣品處理區(qū)；
n3.核酸擴(kuò)增區(qū)；
n4.產(chǎn)物分析區(qū)；
如使用全自動分析儀，區(qū)域可適當(dāng)合并。（進(jìn)入各工作區(qū)域必須嚴(yán)格按照單一方向進(jìn)行，不同的工作區(qū)域使用不同的工作服，例如不同的顏色。工作人員離開各工作區(qū)域時，不得將工作服帶出）
PCR實(shí)驗(yàn)室平面布局
【各區(qū)的功能分別為】
試劑準(zhǔn)備區(qū)：擴(kuò)增試劑的配制、分裝和保存。
樣品處理區(qū)：樣品登記、分裝；核酸提取、保存和加樣。
擴(kuò)增產(chǎn)物分析區(qū)：擴(kuò)增產(chǎn)物的測定、結(jié)果分析、登記及報告。
擴(kuò)增前區(qū)與擴(kuò)增后區(qū)應(yīng)嚴(yán)格分開，須使用不同的房間，兩區(qū)之間最好有一定的間隔。
使用商品化試劑盒可在樣品處理區(qū)進(jìn)行少量試劑配制。
在滿足下列操作和清潔處理要求的前提下樣品處理區(qū)和試劑準(zhǔn)備區(qū)可設(shè)在同一房間內(nèi)：
在生物安全柜內(nèi)操作；
每個實(shí)驗(yàn)人員、實(shí)驗(yàn)組分別使用各自的試劑及耗材；
盛放污染材料的器皿密封并一次性使用；
用有效的方法對操作區(qū)域和共享器具在實(shí)驗(yàn)前后進(jìn)行清潔及消毒。
PCR實(shí)驗(yàn)室建設(shè)規(guī)劃要點(diǎn)
1、主體結(jié)構(gòu)：
主體為彩鋼板、鋁合金型材。室內(nèi)所有陰角、陽角均采用鋁合金50內(nèi)圓角鋁，從而解決容易污染、積塵、不易清掃等問題。結(jié)構(gòu)牢固，線條簡明，美觀大方，密封性好。
2、標(biāo)準(zhǔn)的三區(qū)分隔和氣壓調(diào)節(jié)：
將PCR過程分成試劑準(zhǔn)備、標(biāo)本制備和PCR擴(kuò)增檢測三個獨(dú)立的實(shí)驗(yàn)區(qū)。整個區(qū)域有一個整體緩沖走廊。每個獨(dú)立實(shí)驗(yàn)區(qū)設(shè)置有緩沖區(qū)， 同時各區(qū)通過氣壓調(diào)節(jié)，使整個PCR實(shí)驗(yàn)過程中試劑和標(biāo)本免受氣溶膠的污染并降低擴(kuò)增產(chǎn)物對人員和環(huán)境的污染。
可打開緩沖區(qū)Ⅰ，緩沖區(qū)Ⅱ和 PCR 擴(kuò)增區(qū)的排風(fēng)扇往外排氣，在實(shí)驗(yàn)區(qū)的外墻上和各扇門上都安裝有風(fēng)量可調(diào)的回風(fēng)口，空氣通過回風(fēng)口向室內(nèi)換氣。
3、 消毒：
在三個實(shí)驗(yàn)區(qū)和三個緩沖區(qū)頂部以及傳送窗內(nèi)部安裝有紫外燈，供消毒用。
在試劑準(zhǔn)備區(qū)和標(biāo)本制備區(qū) 還設(shè)置移動紫外線燈，對實(shí)驗(yàn)桌進(jìn)行局部消毒。
4、機(jī)械連鎖不銹鋼傳遞窗：
試劑和標(biāo)本通過機(jī)械連鎖不銹鋼（不建議使用電子連鎖方式）傳遞窗傳遞，保證試劑和標(biāo)本在傳遞過程中不受污染（人物分流）
5、 地面
地面建議使用PVC卷材地面或自流坪地面，整體性好。便于進(jìn)行清掃，耐腐蝕。沒有條件的也可采用水磨石地面，或大塊的瓷磚（至少800mm×800mm）接縫需要小于2mm。
6、照明
燈具要選用凈化燈具，能達(dá)到便于清洗、不積塵的特點(diǎn)。
在建設(shè)的過程中應(yīng)注意
●規(guī)范的安裝流程和全面的服務(wù)流程。
●嚴(yán)格按照規(guī)范科學(xué)設(shè)計的安裝流程。
●安裝前需要確定以下安裝條件，如：電源電壓，電源進(jìn)線位置，電話網(wǎng)絡(luò)線進(jìn)線位置，進(jìn)水水壓，最小安裝空間，地面平整度，通風(fēng)孔、進(jìn)水管和下水管的位置等，理想狀態(tài)的空間尺寸和通風(fēng)口尺寸。
設(shè)計要點(diǎn)
PCR實(shí)驗(yàn)室可以是分散形式，也可以是組合形式。完成一組PCR實(shí)驗(yàn)，通常應(yīng)經(jīng)過試劑配制、樣品處理、核酸擴(kuò)增及產(chǎn)物分析四個實(shí)驗(yàn)過程，若實(shí)驗(yàn)工藝需要，還應(yīng)增加樣品粉碎過程。
一、分散形式PCR實(shí)驗(yàn)室
所謂分散形式PCR實(shí)驗(yàn)室，是指完成上述實(shí)驗(yàn)過程的實(shí)驗(yàn)用房彼此相距較遠(yuǎn)，呈分散布置形式。對于這種布置形式的PCR實(shí)驗(yàn)室，由于各個實(shí)驗(yàn)之間不易相互干擾，因此無需特殊條件要求。
二、組合形式PCR實(shí)驗(yàn)室
所謂組合形式PCR實(shí)驗(yàn)室, 是指完成PCR四個實(shí)驗(yàn)過程的實(shí)驗(yàn)用房相鄰布置，組成獨(dú)立實(shí)驗(yàn)區(qū)域的形式。對于組合形式PCR實(shí)驗(yàn)室，由于各個實(shí)驗(yàn)間集中布置，容易造成相互干擾，因此，對總體布局以及屏障系統(tǒng)具有一定的要求。各室在入口處設(shè)緩沖間，以減少室內(nèi)外空氣交換。
一些經(jīng)驗(yàn)：
試劑配制室及樣品處理室宜呈微正壓，以防外界含核酸氣溶膠的空氣進(jìn)入，造成污染；
可以通過控制進(jìn)風(fēng)風(fēng)量大于排風(fēng)風(fēng)量達(dá)到正壓效果。
核酸擴(kuò)增室及產(chǎn)物分析室應(yīng)呈微負(fù)壓，以防含核酸的氣溶膠擴(kuò)散出去污染試劑與樣品，可以通過控制排風(fēng)風(fēng)量大于進(jìn)風(fēng)風(fēng)量達(dá)到負(fù)壓效果。
在理想情況下，PCR實(shí)驗(yàn)室緩沖間內(nèi)，可設(shè)置正壓，使室內(nèi)空氣不流向室外，室外空氣不流向室內(nèi)。PCR實(shí)驗(yàn)室進(jìn)風(fēng)由原有中央空調(diào)控制，要求將中央空調(diào)風(fēng)口安裝到指定定點(diǎn)，且高度為地面鋪裝好后2600mm處。
如果使用熒光PCR儀，擴(kuò)增室和產(chǎn)物分析室可以合并。
若房間進(jìn)深允許，可設(shè)PCR內(nèi)部專用走廊。需要指出的是在減少室內(nèi)外空氣交換方面，緩沖間比專用走廊更有意義。
各個區(qū)域之間應(yīng)具備單向的實(shí)驗(yàn)工藝流、物流、人流與氣流，形成單向流程的保護(hù)屏障，避免實(shí)驗(yàn)之間的相互干擾，防止核酸氣溶膠對實(shí)驗(yàn)過程造成污染產(chǎn)生假性結(jié)果。
實(shí)驗(yàn)室的墻體，包括頂棚，應(yīng)結(jié)構(gòu)牢固、氣密性好；所有陰角宜采用圓弧形線條過渡；墻體內(nèi)壁光潔、不吸附、耐腐蝕、易清洗消毒；地面材料應(yīng)滿足無縫隙、無滲漏、光潔、耐腐蝕的要求。
PCR實(shí)驗(yàn)室主要設(shè)備
試劑準(zhǔn)備區(qū)
儀器設(shè)備主要有冰箱、超凈臺、加樣器、混勻器、天平和離心機(jī)等，加樣器、天平除了要專用外，還應(yīng)有定期校準(zhǔn)。試劑分裝應(yīng)在超凈臺中進(jìn)行 擴(kuò)增反應(yīng)混合液應(yīng)使用分子生物學(xué)級的，試劑制備好后應(yīng)有質(zhì)檢：一是否有污染、二是檢測試劑的擴(kuò)增效果。
標(biāo)本制備區(qū)
儀器設(shè)備主要有生物安全柜、加樣器、離心機(jī)、溫育儀、混勻器等
擴(kuò)增區(qū)
擴(kuò)增區(qū)的主要儀器是核酸擴(kuò)增儀、超凈臺、微量加樣器、離心機(jī)、可移動紫外燈。擴(kuò)增儀需進(jìn)行校準(zhǔn)。并配備UPS電源，以防止由于電壓的波動，停電對擴(kuò)增效果的影響。
分析區(qū)
本區(qū)所使用的儀器設(shè)備有酶標(biāo)儀、洗板機(jī)、加樣器和水浴箱等 潔凈實(shí)驗(yàn)區(qū)的緩沖間部分面積不能超過主實(shí)驗(yàn)室的八分之一,這是有規(guī)定的。
一些瑣碎的、不可忽略的設(shè)計
1.實(shí)驗(yàn)室空調(diào)通風(fēng)系統(tǒng)設(shè)計及壓力控制
PCR實(shí)驗(yàn)室并沒有嚴(yán)格的凈化要求，但是為避免各個實(shí)驗(yàn)區(qū)域間交叉污染的可能性，宜采用全送全排的氣流組織形式。同時，要嚴(yán)格控制送、排風(fēng)的比例以保證各實(shí)驗(yàn)區(qū)的壓力要求。
2.污染的預(yù)防與控制
PCR實(shí)驗(yàn)室設(shè)計的核心問題是如何避免污染。在實(shí)際工作中，常見的有以下幾種污染類型：擴(kuò)增產(chǎn)物的污染；天然基因組DNA的污染；試劑的污染以及標(biāo)本間的污染。由于一旦發(fā)生污染，實(shí)驗(yàn)就必須停止，直到找到污染源為止，而且實(shí)驗(yàn)結(jié)果必須作廢，需重新進(jìn)行實(shí)驗(yàn)。所以發(fā)生污染后再圍繞實(shí)驗(yàn)室來尋找污染源不但耗時而且繁瑣，浪費(fèi)人力物力。因此要避免污染，首先應(yīng)是預(yù)防，而不是排除。
PCR實(shí)驗(yàn)室不可缺少的嚴(yán)格管理
（1）嚴(yán)格控制進(jìn)出實(shí)驗(yàn)室的人員。與實(shí)驗(yàn)無關(guān)的人員不得隨意進(jìn)出實(shí)驗(yàn)室，有條件的情況下要設(shè)置獨(dú)立的通道和進(jìn)出整個實(shí)驗(yàn)區(qū)的門；
（2）盡量減少在實(shí)驗(yàn)區(qū)內(nèi)不必要的走動以減少交叉污染的可能性。
（3）擴(kuò)增產(chǎn)物分析區(qū)是最主要的擴(kuò)增產(chǎn)物污染來源，廢液不能在實(shí)驗(yàn)室中傾倒，必須經(jīng)消毒液浸泡消毒后在遠(yuǎn)離實(shí)驗(yàn)室的地方棄掉，用過的吸頭等一次性材料也應(yīng)經(jīng)消毒液浸泡消毒后統(tǒng)一處理，如焚燒等；
（4）擴(kuò)增產(chǎn)物分析區(qū)可能會用到某些可致基因突變和有毒物質(zhì)，應(yīng)特別注意實(shí)驗(yàn)人員的安全防護(hù)。3.5完備的實(shí)驗(yàn)室配套設(shè)施 完備的實(shí)驗(yàn)室配套設(shè)施是保證實(shí)驗(yàn)工作的必要條件，應(yīng)根據(jù)各個實(shí)驗(yàn)室實(shí)驗(yàn)內(nèi)容的不同配備相應(yīng)的設(shè)備和儀器，如超凈工作臺、離心機(jī)、加樣器等。
二、 PCR實(shí)驗(yàn)室防污染措施及應(yīng)急處理方法
污染，是PCR實(shí)驗(yàn)室出現(xiàn)實(shí)驗(yàn)假陽性、結(jié)果不可信、研發(fā)不可靠的重要推手，PCR實(shí)驗(yàn)室應(yīng)當(dāng)將防污染作為日常管理、實(shí)驗(yàn)安排、清潔消毒、實(shí)驗(yàn)習(xí)慣的核心。PCR 實(shí)驗(yàn)污染和細(xì)胞污染是有差別的，PCR 實(shí)驗(yàn)污染主要是核酸而不是細(xì)菌和其他入侵者。因此所有的預(yù)防措施都會稍稍有所不同。“易查不易察”，污染來的悄無聲息，我們該如何應(yīng)對。今天給大家簡單介紹一下PCR實(shí)驗(yàn)室的主要污染來源、實(shí)驗(yàn)中如何避免和減少污染的可能性及實(shí)驗(yàn)發(fā)生污染的應(yīng)急處理方案。
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PCR實(shí)驗(yàn)室的污染來源
1、樣本間交叉污染：
收集樣本的容器被污染或樣本密封不嚴(yán)外溢；不同樣本移液時忘記更換槍尖或未使用帶濾芯槍尖；移液器等實(shí)驗(yàn)器具及耗材未及時消毒滅菌；不同樣本同時開蓋或樣本劇烈震蕩、反復(fù)吹吸導(dǎo)致氣溶膠形成擴(kuò)散，相互交叉污染。
2、實(shí)驗(yàn)試劑污染：
主要是在 PCR 組分試劑加樣過程中，由于移液器、容器、陰性對照及其它試劑被核酸模板或陽性對照污染。 加樣過程中，因?yàn)?PCR 試劑對溫度十分敏感，需要通過冰浴使得 PCR 試劑和 PCR 板/管處于 0℃，但這個過程也是充滿了污染的風(fēng)險的。
3、擴(kuò)增產(chǎn)物污染：
大量拷貝的產(chǎn)物泄漏或擴(kuò)增后的PCR反應(yīng)管意外開蓋，這是 PCR 反應(yīng)中最主要最常見的污染問題。因?yàn)?PCR 產(chǎn)物拷貝量大，遠(yuǎn)遠(yuǎn)高于 PCR 檢測數(shù)個拷貝的極限，所以極微量的 PCR 產(chǎn)物污染，就可形成假陽性。
4、克隆質(zhì)粒污染：
作為陽性質(zhì)控品的克隆質(zhì)粒外溢。
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PCR實(shí)驗(yàn)室的防污染方法
按照實(shí)驗(yàn)室的安全工作制度或安全標(biāo)準(zhǔn)操作程序，所有操作符合《實(shí)驗(yàn)室生物安全通用要求》（GB19489-2008）。
1、嚴(yán)格執(zhí)行各區(qū)功能劃分：
試劑儲存和準(zhǔn)備區(qū)：貯存試劑的制備、試劑的分裝和擴(kuò)增反應(yīng)混合液的準(zhǔn)備，以及離心管、吸頭等消耗品的貯存和準(zhǔn)備。
標(biāo)本制備區(qū)：核酸（RNA、DNA）提取、貯存及其加入至擴(kuò)增反應(yīng)管。對于涉及臨床樣本的操作，應(yīng)符合生物安全二級實(shí)驗(yàn)室防護(hù)設(shè)備、個人防護(hù)和操作規(guī)范的要求。
擴(kuò)增區(qū)：cDNA合成、DNA擴(kuò)增及檢測。
擴(kuò)增產(chǎn)物分析區(qū)：擴(kuò)增片段的進(jìn)一步分析測定，如雜交、酶切電泳、變性高效液相分析、測序等。
試劑準(zhǔn)備區(qū)、樣本制備區(qū)和擴(kuò)增區(qū)內(nèi)的實(shí)驗(yàn)用品，包括移液器等器具應(yīng)專用，空氣、物品流向依次為：試劑準(zhǔn)備區(qū)、樣本制備區(qū)、擴(kuò)增區(qū)、產(chǎn)物分析區(qū)，不可逆行。
2、清潔的實(shí)驗(yàn)用品：
實(shí)驗(yàn)室自配試劑（去離子水、緩沖液等）和所有使用器具在使用之前均應(yīng)高壓滅菌或紫外殺菌。槍尖、反應(yīng)管等實(shí)驗(yàn)耗材應(yīng)一次性使用。
3、正確的實(shí)驗(yàn)操作：
實(shí)驗(yàn)應(yīng)在超凈工作臺內(nèi)進(jìn)行，工作臺內(nèi)應(yīng)放置PCR專用的微量離心機(jī)、各量程的移液器和其他必須物品。
實(shí)驗(yàn)的過程中選擇最合適尺寸的手套并能及時更換，在進(jìn)出不同實(shí)驗(yàn)區(qū)域或進(jìn)行模板操作后都應(yīng)更換實(shí)驗(yàn)服、口罩、帽子及手套，以避免不同實(shí)驗(yàn)區(qū)交叉污染。
裝有PCR試劑的反應(yīng)管在打開之前應(yīng)先瞬時離心，將管壁及管蓋上的液體離至管底，降低污染手套或加樣器的風(fēng)險；謹(jǐn)慎開啟反應(yīng)管，防止管內(nèi)液體濺出或形成氣溶膠導(dǎo)致污染。
吸加試劑和模板的操作應(yīng)嚴(yán)格按照規(guī)范要求進(jìn)行，遵守“慢吸快打”原則，盡量一次性完成，忌多次抽吸，以避免氣溶膠產(chǎn)生的交叉污染。
PCR試劑建議小量分裝，以減少反復(fù)凍融、重復(fù)取樣次數(shù)；多樣本PCR反應(yīng)時，先配制反應(yīng)混合液分裝至反應(yīng)管中，最后加入樣本核酸，請勿同時開蓋，盡量保證單人單管，實(shí)現(xiàn)完全閉管操作。
實(shí)驗(yàn)試劑應(yīng)與樣品和PCR產(chǎn)物分開保存，不應(yīng)放于同處。
PCR擴(kuò)增實(shí)驗(yàn)完成后及時將反應(yīng)管取出，用一次性手套將產(chǎn)物反應(yīng)管包裹丟棄，保證管蓋緊閉。
4、規(guī)范的實(shí)驗(yàn)設(shè)計：
應(yīng)遵循實(shí)驗(yàn)室內(nèi)部質(zhì)量控制的相關(guān)規(guī)定，實(shí)驗(yàn)中設(shè)立陽性對照、陰性對照和空白對照，全程質(zhì)控實(shí)驗(yàn)過程，驗(yàn)證PCR反應(yīng)的可靠性，并協(xié)助判斷擴(kuò)增系統(tǒng)的可信性。
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PCR實(shí)驗(yàn)室的污染應(yīng)急處理方法
1、若核酸樣本溢出：
立即用布或紙巾覆蓋，由外圍向中心傾倒10%的次氯酸消毒劑，約30分鐘后，清除污染物品，再用次氯酸消毒劑擦拭，并用75%酒精噴灑，移動紫外車定點(diǎn)照射1小時。
2、其他不明情況污染：
1、暫停所有實(shí)驗(yàn)操作；
2、清理實(shí)驗(yàn)室內(nèi)所有物品，尋找污染來源；
3、加大實(shí)驗(yàn)室的通風(fēng)；
4、對實(shí)驗(yàn)室內(nèi)所有表面（臺面、地面及墻面） 進(jìn)行消毒；
5、75%酒精空中噴霧；
6、開啟紫外消毒裝置，延長紫外照射時間（4小時以上）；
7、以上措施每日進(jìn)行，直至污染消除；用新試劑及確認(rèn)無污染的器材進(jìn)行原污染項目的試劑空白檢測，連續(xù)3次均陰性后方可進(jìn)行常規(guī)檢測。
